flowPřístrojové vybavení Centra pro Cytometrii a Mikroskopii MBÚ AVČR v.v.i.

Cytometrie

  1. Průtokový cytometr BD LSRII pro analýzu až 18 fluorescenčních kanálů + dva kanály pro rozptyl světla (FSC + SSC)

  2. Průtokový cytometr s buněčným sortem S3 pro třídění buněk v 4 fluorescenčních kanálech a dva kanály pro rozptyl světla (FSC + SSC)

  3. Skenovací cytometr Compucyte iCys pro analýzu přisedlých buněk a tkáňových řezů ve čtyřech fluorescenčních kanálech

  4. Fluorescenční mikroskop Olympus AX70-Provis vybavený modulem Cell^R pro live-cell imaging

  5. Fluorescenční systém OV-100 určený pro analýzu fluorescence na úrovni organismu

  6. Konfokální mikroskop OLYMPUS FV-1000 optimalizovaný pro FRAP, FLIP, vybavený modulem TIRF a OSR - vhodné pro superrezoluční snímání

  7. Analytický server se SW Huygens pro precizní a rychlou analýzu obrazu

microscopePřístrojové vybavení Centra pro Cytometrii a Mikroskopii MBÚ AVČR v.v.i.

Mikroskopie

  1. Fluorescenční mikroskop Olympus AX70-Provis vybavený modulem Cell^R pro live-cell imaging

  2. Fluorescenční systém OV-100 určený pro analýzu fluorescence na úrovni organismu

  3. Konfokální mikroskop OLYMPUS FV-1000 optimalizovaný pro FRAP, FLIP, a vybavený modulem TIRF, SIM a OSR

  4. Průtokový cytometr BD LSRII pro analýzu až 18 fluorescenčních kanálů + dva kanály pro rozptyl světla (FSC + SSC)

  5. Průtokový cytometr s buněčným sortem S3 pro třídění buněk v 4 fluorescenčních kanálech a dva kanály pro rozptyl světla (FSC + SSC)

  6. Skenovací cytometr Compucyte iCys pro analýzu přisedlých buněk a tkáňových řezů ve čtyřech fluorescenčních kanálech

  7. Analytický server se SW Huygens pro precizní a rychlou analýzu obrazu.

LSR II

image002 image004

Centrum pro cytometrii a mikroskopii MBÚ AV ČR je vybaveno 16-ti barevným průtokovým cytometrem BD LSRII včetně FACS Flow Supply Systému a High Throughput Sampleru.

Přístroj byl modifikován Dr. Horváthem (Flow Cytometry and Microscopy facility of IMG) pro 4 excitační zdroje:

Hardwarová konfigurace

1. Optická část

405nm, 100mW - OBIS solid state (70mW regulovaně)

488nm, 20mW - Coherent Sapphire 488-20 DPSS laser

561nm, 25mW - Melles Griot 85-YCA-025

633nm, 17mW - JDS Uniphase 1144P He-Ne laser

image006

detektory405 405

Fialový laser, 405nm, 6 fotodetektorů

detektory488 488

Modrý laser, 488nm, 4 fotodetektory

detektory561 561

Žlutý laser, 561nm, 6 fotodetektorů

detektory633 633

Červený laser, 633nm, 3 fotodetektory

K dispozici je sada optických filtrů a zrcadel umožňujících co nejširší využití přístroje podle požadavků uživatele.

Emisní filtry Dichroická zrcadla
425/20 440 LP
450/50 475 LP
488/10 505 LP
525/50 545 LP
530/30 550 LP
560/10 565 LP
560/20 575 LP
575/15 590 LP
575/26 595LP
585/15 600 LP
585/42 630 LP
605/12 635 LP
610/20 650 LP
655/8 658 LP
660/16 675 LP
660/20 680 LP
670/14 685 LP
675/20 710 LP
675/45 735 LP
685/35 755 LP
695/20
695/40
705/20
712/21
725/20
750/60
780/60
705/20

image010

image012

2. High Throughput Sampler (HTS)

image033HTS je zařízení, které umožňuje automatické měření vzorků průtokovým cytometrem přímo z 96 nebo 384 jamkových desek.

Zařízení se skládá ze dvou základních částí:

  1. pohyblivého ramene s jehlou, které obstarává míchání a manipulaci se vzorky, míchání buněk v jamkách, nasátí a injektáž vzorku do cytometru.

  2. pohyblivý stolek pro destičky.

Podrobný manuál k HTS (PDF)

3. Ovládací software:

BD FACS DiVa 6 

Obsluha přístroje:

1. Zapnutí

1. KROK: Před zapnutím přístroje zkontrolujte hladiny kapalin v nádobách FACS Flow Supply Systemu (FFSS).

Sheath kanystr nesmí být nikdy prázdný, dochází k zavzdušnění přístroje, které pak přináší dlouhodobou nestabilitu systému a znehodnocuje naměřená data.image014

2. KROK: Přístroj se uvádí do provozu stisknutím zeleného tlačítka na pravé straně čelního panelu přístroje.

3. KROK: Po zapnutí LSRII spusťte ovládací program FACS DiVa, po přihášení do programu se otevře výchozí sestava oken.

image059

Počkejte až dojde k připojení cytometru k počítači. O stavu připojení jste informováni ikonou v pravém dolním rohu.

Než začnete měřit, nechte přístroj cca 10min stabilizovat.

2. Provoz

image023

Vlastní obsluha LSRII je řízena tlačítky na čelním panelu přístroje.

Fluidními ovladači LoMed a Hi regulujeme rychlost nasávání vzorku, ovladač Sample Fine Adj slouží k jemnému doladění průtoku..

Tyto ovladače jsou funkční pouze při práci se zkumavkami, při práci s HTS je rychlost nasávání vzorku nastavována softwarově.

Orientační průtoky:

  Rozsah (ul/min) Střed (ul/min)
Low 6 - 24 12
Medium 18 - 70 35
High 30 - 120 60

Tlačítkem Run spustíte nasávání vzorku přístrojem. V tomto módu neustále protéká přístrojem kapalina. Přístroj se do stavu Run přepíná pouze během měření.

Standby je pohotovostní režim. Do tohoto režimu uveďte přístroj vždy po u končení měření.

Prime slouží k pročištění měřící komory.

FACS Flow Supply System (FFSS)image025

FFSS je systém zajišťující průtok a stálý tlak nosné kapaliny v průtokovém cytometru. Systém se skládá z kontrolního panelu a dvou nádob.

Spouští se zapnutím průtokového cytometru. Vypínač na pravé straně ovládacího panelu zůstává stale zapnutý, svítí zelená kontrolka "System on".

Levá nádoba (PE kanystr) je určena na sheath fluid = nosnou kapalinu. PBS naředíte z 10 x koncentrovaného zásobního roztoku (1 litr 10 x PBS + 9 litrů deionizované H2O)

Pravá nádoba je odpadní, při vyprázdnění přidáme cca 100ml SAVA.

Pokud během měření dojde Sheath fluid, případně dojde k naplnění odpadní nádoby spustí FFSS zvukovou signalizaci. Na čelním panelu se rozsviti červená kontrolka, která nás informuje o příčině alarmu.

image027 image029
Pískot musíte vypnout stiskem talčítka alarm, přepněte FACS na Standby, doplňte/vylijte tekutiny image031

!!!!!!!!!!!!!!! STISKNĚTE RESTART !!!!!!!!!!!!!!!

- zhasne červená kontrolka, přepněte FACS na Run a pokračujte v měření.

High Throughput Sampler (HTS)

HTS umístíte na stojan a lehce zasunete do cytometru. Při instalaci je třeba sledovat aby nedošlo k poškození nasávací jehly, nebo k uskřípnutí hadiček.

Připojte fluidní system:

    1. Bílá hadička s bílými konektory SHEATH (B), oranžová hadička s oranžovými konektory WASTE (A).
    image035 image037
      1. Nasaďte Sample Tubing na jehlu, OPATRŇE A ZLEHKA dotáhněte.
      image041 image039
        1. Propojte elektroniku přístrojů pomocí RS232 konektoru a napájení zařízení.
        image043
          1. Zapněte zařízení vypínačem umístěným na pravé straně přístroje, rozsvítí se zelená dioda.
          image045 image047
            1. Na LSRII přepněte nasávání vzorku ze zkumavky na nasávání z destičky.
            image050

            Komunikaci mezi DIVA softwarem a HTS obstarává HTS menu v DIVA softwaru.

            HTS1

            Před vlastním měřením je vhodné HTS proprat. Přepněte LSR II ze StandBy modu do stavu Run a v HTS menu DIVA softwaru klikneme na ikonu Prime.

            HTS2

            O ukončení cyklu přístroj informuje akusticky a softwarově.

            1. Pokud jste provedli všechny předchozí kroky a zkontrolovali nastavení přístroje, můžete zahájit měření.

            3. Vypnutí přístroje

            Vyexportujte si naměřená data.  DATA STARŠÍ 6 MĚSÍCŮ JSOU MAZÁNA.

            Pokud jste používali jinou než standardní konfiguraci filtrů a zrcadel, vráťte přístroj do standardní konfigurace.

            Po ukončení měření je třeba proprat HTS jednotkuimage056

            Připravte 96 jamkovou U desku:

            1. do pozice A1-A4 přidejte po 200ul 10% SAVO
            2. do pozice B1-B4 přidejte 200 ul deionizované vody

            Instalujte desku na HTS a z HTS menu DIVA softwaru spusťte "HTS daily clean" čistící program.

            image060

            Celá procedura trvá cca 10min. O jejím ukončení budete informováni softwarově a akusticky.

            Po práci ve zkumavkách přepněte LSR do HIGH modu a nasaďte zkumavku s 10% SAVEM, kterou po 2 minutách vyměnte za zkumavku s deionizovanou vodou kterou necháte přístroj propírat také 2 minuty. Po té nasaďte zkumavku s 2ml deionizované vody a přepněte LSRII do Standby modu.

            FACS Vantage SE

            image004

            FACS Vantage je průtokový cytometr s vysokorychlostním sorterem.

            Konfigurace našeho přístroje umožňuje třídit až dvě nezávislé buněčné populace na základě osmiparametrické analýzy vzorků včetně pulse processingu. Dostupná je 365nm, 488nm a 633nm excitace. Součástí přístroje je klonovací jednotka, která umožňuje separovat buňky v předem definovaném počtu do mikrotitračních desek, nebo na mikroskopická sklíčka.

            1) Konfigurace přístroje:

            Excitační zdroje:

            Coherent Enterprise II-621, vodou chlazený ArKr laser poskytující záření UV (351-364nm), 50mW a 488nm, 200mW.

            Melles Griot HeNe laser 65-64LP-991 poskytující záření 633nm, 30mW

            8 detekčních kanálů:

            2 Light Scattery (FSC, SSC)

            6 fluorscencí (FL1-FL6), 4 fluorescence 488 excitace, 2 fluorescence UV nebo 633 excitace

            Sortovací modul:

            Standard: 6000 buněk/sec

            TurboSort: 25 000 buněk/sec

            ClonCyt: Aplikace umožňující sorting do kultivačních desek a na sklíčko.

            Software:

            BDCellQuest 

            image006

            Typická konfigurace:

            Excitační vlnová délka Fluorescenční kanál Filtr Typický fluorochrom
            488 nm FL1 530/30 FITC, Alexa488, GFP
              FL2 575/42 PE
              FL3 630/22 PI
              FL6 740LP PE-Cy7
            365 nm FL4 450/50 Hoechst Blue
              FL5 660/20 Hoechst Red
            633 nm FL5 660/20 APC

            Dostupné filtry a zrcadla:

               Filtry        Zrcadla    
            405/43 450 DCLP
            424/44 560 SP
            450/58 610 SP
            495/20 640 LP
            530/30 710 DRLP
            575/26  
            585/42  
            630/22  
            660/20  
            682/22  
            695/40  
            712/20  
            740 LP  
            image011image009

            Konfigurace detektorů přístroje FACSVantage SE

            image012

            2) Buněčný sorting je specifickou aplikací průtokové cytometrie.

            Centrum průtokové cytometrie používá FACSVantage SE, který patří do skupiny kapičkových sorterů, (jet in air, open air sorter). Tryska ze které vychází proud buněk je rozkmitána piezoelektrickým krystalem. Tím je proud kapaliny s buňkami rozdělen do kapiček. Kapičce, která splňuje kriteria sortu je udělen elektrostatický náboj a při průchodu mezi vysokonapěťovými elektrodami je kapička vychýlena z dráhy a zachycena do sběrné nádoby. Přístroj je schopen sortovat současně dvě nezávislé buněčné populace.

            image001

            Čistota separované frakce, stejně tak jako výtěžek závisí na kvalitě vzorku a zvolených parametrech sortu které se odvíjí od požadavků na separované buňky. Obecně lze říci, že čím vyšší jsou požadavky na čistotu separované frakce, která se při nejpřísnějším sortovacím režimu limitně blíží 100%, tím nižší lze očekávat výtěžek.

            3) Nejčastěji používané aplikace:

            GFP sorty, separace vzácných lymfocytárních populací, izolace spermatogoniálních buněk.

            GFP sort HeLa buněk

            Výchozí vzorek Sortované buňky Čistota separované frakce
            image019 image017 image015
            Porovnání GFP exprese sortovaných a nesortovaných buněk
            image021

            Sort lidských NK a NK-T lymfocytů

            Výchozí vzorek
            image023
            Sortovaná populace CD3+CD56+ Sortovaná populace CD3-CD56+
            image031 image029
            Reanalýza sortu
            Sortovaná populace CD3+CD56+ Sortovaná populace CD3-CD56+
            image033 image035

            Analýza myších spermatogoniálních buněk

            image039 image037

            Rozlišení přístroje na jednotlivých fluorescenčních detektorech.

            image041

            Spherotech Rainbow Calibration Particles (8 Peaks) RCP-30-5A

            Vybavení laboratoře:

            Tkáňový box, termostat, centrifuga

            Laboratoř je zařazena do kategorie A pro práci s GMO.

            Sterilita vzorků:

            Přístroj je provozován v semisterilním provozu. Pracujeme se sterilními roztoky a laboratoř je vybavena účinnou klimatizací včetně hepafiltru.

            Požadavky na kvalitu vzorků:

            Fyzikální vlastnosti:

            Během sortu jsou buňky stresovány vysokým tlakem a průchodem úzkou kapilárou. Pro křehké a velké buňky je třeba upravit sortovací podmínky.

            Kontroly:

            Pro správné definování požadované buněčné populace je vhodné mít připraveny kontrolní vzorky.

             1) čisté, neznačené buňky, negativní kontrolu

             2) u vícebarevného značení „jednobarevné kontroly“ - vzorky kde bude použit jen jeden fluorochrom.

            Množství buněk/ výtěžek:

            Výtěžek sortu závisí na dvou faktorech. Požadované čistotě a kvalitě vzorku. Obecně lze říct, že čím vyšší čistotu požadujete, tím přísnější jsou kriteria sortu a tím menší je výtěžek. K velkým ztrátám vzorku dochází během značení buněk. S každým praním a s každou filtrací se přichází o část vzorku.

            V praxi se osvědčilo počítat s 50% ztrátami během značení a sortingu.

            Pořebujeme-li tedy získat 1000 buněk, které tvoří ve výchozím vzorku 10% populaci tak je vhodné počítat se 20 000 buňkami výchozího materiálu.

            Příprava vzorku:

            Příprava vzorků závisí velkou měrou na typu buněk se kterými klient pracuje.

            Pro zdárný průběh sortu je nezbytné aby byl vzorek v suspenzi během celého procesu. U buněk, které se „lepí“ (např. makrofágy) se obvykle vzorky připravují v Ca2+/Mg2+ free mediu, v některých případech se osvědčil i obsah 0,1mM EDTA.

            Před vlastním sortem se vzorek převede do bezsérového media, obvyklá je koncentrace 1x107/ml.

            Doba trvání sortu:

            Délka soru závisí opět na kvalitě vzorku a typu buněk. Sort velkých, křehkých, adherentních buňek bude trvat delší dobu než sort buněk malých (např. thymocytů).

            Orientační doba trvání sortu pro 1x106 buněk výchozího materiálu za optimálních podmínek

              makrofágy thymocyty
            1x106 buněk 3 minuty 3/4 minuty

            V REKONSTRUKCI