LSR II

image002 image004

Centrum pro cytometrii a mikroskopii MBÚ AV ČR je vybaveno 16-ti barevným průtokovým cytometrem BD LSRII včetně FACS Flow Supply Systému a High Throughput Sampleru.

Přístroj byl modifikován Dr. Horváthem (Flow Cytometry and Microscopy facility of IMG) pro 4 excitační zdroje:

Hardwarová konfigurace

1. Optická část

405nm, 100mW - OBIS solid state (70mW regulovaně)

488nm, 20mW - Coherent Sapphire 488-20 DPSS laser

561nm, 25mW - Melles Griot 85-YCA-025

633nm, 17mW - JDS Uniphase 1144P He-Ne laser

image006

detektory405 405

Fialový laser, 405nm, 6 fotodetektorů

detektory488 488

Modrý laser, 488nm, 4 fotodetektory

detektory561 561

Žlutý laser, 561nm, 6 fotodetektorů

detektory633 633

Červený laser, 633nm, 3 fotodetektory

K dispozici je sada optických filtrů a zrcadel umožňujících co nejširší využití přístroje podle požadavků uživatele.

Emisní filtry Dichroická zrcadla
425/20 440 LP
450/50 475 LP
488/10 505 LP
525/50 545 LP
530/30 550 LP
560/10 565 LP
560/20 575 LP
575/15 590 LP
575/26 595LP
585/15 600 LP
585/42 630 LP
605/12 635 LP
610/20 650 LP
655/8 658 LP
660/16 675 LP
660/20 680 LP
670/14 685 LP
675/20 710 LP
675/45 735 LP
685/35 755 LP
695/20
695/40
705/20
712/21
725/20
750/60
780/60
705/20

image010

image012

2. High Throughput Sampler (HTS)

image033HTS je zařízení, které umožňuje automatické měření vzorků průtokovým cytometrem přímo z 96 nebo 384 jamkových desek.

Zařízení se skládá ze dvou základních částí:

  1. pohyblivého ramene s jehlou, které obstarává míchání a manipulaci se vzorky, míchání buněk v jamkách, nasátí a injektáž vzorku do cytometru.

  2. pohyblivý stolek pro destičky.

Podrobný manuál k HTS (PDF)

3. Ovládací software:

BD FACS DiVa 6 

Obsluha přístroje:

1. Zapnutí

1. KROK: Před zapnutím přístroje zkontrolujte hladiny kapalin v nádobách FACS Flow Supply Systemu (FFSS).

Sheath kanystr nesmí být nikdy prázdný, dochází k zavzdušnění přístroje, které pak přináší dlouhodobou nestabilitu systému a znehodnocuje naměřená data.image014

2. KROK: Přístroj se uvádí do provozu stisknutím zeleného tlačítka na pravé straně čelního panelu přístroje.

3. KROK: Po zapnutí LSRII spusťte ovládací program FACS DiVa, po přihášení do programu se otevře výchozí sestava oken.

image059

Počkejte až dojde k připojení cytometru k počítači. O stavu připojení jste informováni ikonou v pravém dolním rohu.

Než začnete měřit, nechte přístroj cca 10min stabilizovat.

2. Provoz

image023

Vlastní obsluha LSRII je řízena tlačítky na čelním panelu přístroje.

Fluidními ovladači LoMed a Hi regulujeme rychlost nasávání vzorku, ovladač Sample Fine Adj slouží k jemnému doladění průtoku..

Tyto ovladače jsou funkční pouze při práci se zkumavkami, při práci s HTS je rychlost nasávání vzorku nastavována softwarově.

Orientační průtoky:

  Rozsah (ul/min) Střed (ul/min)
Low 6 - 24 12
Medium 18 - 70 35
High 30 - 120 60

Tlačítkem Run spustíte nasávání vzorku přístrojem. V tomto módu neustále protéká přístrojem kapalina. Přístroj se do stavu Run přepíná pouze během měření.

Standby je pohotovostní režim. Do tohoto režimu uveďte přístroj vždy po u končení měření.

Prime slouží k pročištění měřící komory.

FACS Flow Supply System (FFSS)image025

FFSS je systém zajišťující průtok a stálý tlak nosné kapaliny v průtokovém cytometru. Systém se skládá z kontrolního panelu a dvou nádob.

Spouští se zapnutím průtokového cytometru. Vypínač na pravé straně ovládacího panelu zůstává stale zapnutý, svítí zelená kontrolka "System on".

Levá nádoba (PE kanystr) je určena na sheath fluid = nosnou kapalinu. PBS naředíte z 10 x koncentrovaného zásobního roztoku (1 litr 10 x PBS + 9 litrů deionizované H2O)

Pravá nádoba je odpadní, při vyprázdnění přidáme cca 100ml SAVA.

Pokud během měření dojde Sheath fluid, případně dojde k naplnění odpadní nádoby spustí FFSS zvukovou signalizaci. Na čelním panelu se rozsviti červená kontrolka, která nás informuje o příčině alarmu.

image027 image029
Pískot musíte vypnout stiskem talčítka alarm, přepněte FACS na Standby, doplňte/vylijte tekutiny image031

!!!!!!!!!!!!!!! STISKNĚTE RESTART !!!!!!!!!!!!!!!

- zhasne červená kontrolka, přepněte FACS na Run a pokračujte v měření.

High Throughput Sampler (HTS)

HTS umístíte na stojan a lehce zasunete do cytometru. Při instalaci je třeba sledovat aby nedošlo k poškození nasávací jehly, nebo k uskřípnutí hadiček.

Připojte fluidní system:

    1. Bílá hadička s bílými konektory SHEATH (B), oranžová hadička s oranžovými konektory WASTE (A).
image035 image037
    1. Nasaďte Sample Tubing na jehlu, OPATRŇE A ZLEHKA dotáhněte.
image041 image039
    1. Propojte elektroniku přístrojů pomocí RS232 konektoru a napájení zařízení.
image043
    1. Zapněte zařízení vypínačem umístěným na pravé straně přístroje, rozsvítí se zelená dioda.
image045 image047
    1. Na LSRII přepněte nasávání vzorku ze zkumavky na nasávání z destičky.
image050

Komunikaci mezi DIVA softwarem a HTS obstarává HTS menu v DIVA softwaru.

HTS1

Před vlastním měřením je vhodné HTS proprat. Přepněte LSR II ze StandBy modu do stavu Run a v HTS menu DIVA softwaru klikneme na ikonu Prime.

HTS2

O ukončení cyklu přístroj informuje akusticky a softwarově.

  1. Pokud jste provedli všechny předchozí kroky a zkontrolovali nastavení přístroje, můžete zahájit měření.

3. Vypnutí přístroje

Vyexportujte si naměřená data.  DATA STARŠÍ 6 MĚSÍCŮ JSOU MAZÁNA.

Pokud jste používali jinou než standardní konfiguraci filtrů a zrcadel, vráťte přístroj do standardní konfigurace.

Po ukončení měření je třeba proprat HTS jednotkuimage056

Připravte 96 jamkovou U desku:

  1. do pozice A1-A4 přidejte po 200ul 10% SAVO
  2. do pozice B1-B4 přidejte 200 ul deionizované vody

Instalujte desku na HTS a z HTS menu DIVA softwaru spusťte "HTS daily clean" čistící program.

image060

Celá procedura trvá cca 10min. O jejím ukončení budete informováni softwarově a akusticky.

Po práci ve zkumavkách přepněte LSR do HIGH modu a nasaďte zkumavku s 10% SAVEM, kterou po 2 minutách vyměnte za zkumavku s deionizovanou vodou kterou necháte přístroj propírat také 2 minuty. Po té nasaďte zkumavku s 2ml deionizované vody a přepněte LSRII do Standby modu.