FACS Vantage SE

FACS Vantage je průtokový cytometr s vysokorychlostním sorterem.

Konfigurace našeho přístroje umožňuje třídit až dvě nezávislé buněčné populace na základě osmiparametrické analýzy vzorků včetně pulse processingu. Dostupná je 365nm, 488nm a 633nm excitace. Součástí přístroje je klonovací jednotka, která umožňuje separovat buňky v předem definovaném počtu do mikrotitračních desek, nebo na mikroskopická sklíčka.

1) Konfigurace přístroje:

Excitační zdroje: Coherent Enterprise II-621, vodou chlazený ArKr laser poskytující záření UV (351-364nm), 50mW a 488nm, 200mW. Melles Griot HeNe laser 65-64LP-991 poskytující záření 633nm, 30mW 8 detekčních kanálů: 2 Light Scattery (FSC, SSC) 6 fluorscencí (FL1-FL6), 4 fluorescence 488 excitace, 2 fluorescence UV nebo 633 excitace Sortovací modul: Standard: 6000 buněk/sec TurboSort: 25 000 buněk/sec ClonCyt: Aplikace umožňující sorting do kultivačních desek a na sklíčko. Software: BDCellQuest

Typická konfigurace:

Excitační vlnová délka	Fluorescenční kanál	Filtr	Typický fluorochrom
488 nm	FL1	530/30	FITC, Alexa488, GFP
	FL2	575/42	PE
	FL3	630/22	PI
	FL6	740LP	PE-Cy7
365 nm	FL4	450/50	Hoechst Blue
	FL5	660/20	Hoechst Red
633 nm	FL5	660/20	APC

Dostupné filtry a zrcadla:

Filtry        Zrcadla     405/43 450 DCLP 424/44 560 SP 450/58 610 SP 495/20 640 LP 530/30 710 DRLP 575/26   585/42   630/22   660/20   682/22   695/40   712/20   740 LP

Konfigurace detektorů přístroje FACSVantage SE

2) Buněčný sorting je specifickou aplikací průtokové cytometrie.

Centrum průtokové cytometrie používá FACSVantage SE, který patří do skupiny kapičkových sorterů, (jet in air, open air sorter). Tryska ze které vychází proud buněk je rozkmitána piezoelektrickým krystalem. Tím je proud kapaliny s buňkami rozdělen do kapiček. Kapičce, která splňuje kriteria sortu je udělen elektrostatický náboj a při průchodu mezi vysokonapěťovými elektrodami je kapička vychýlena z dráhy a zachycena do sběrné nádoby. Přístroj je schopen sortovat současně dvě nezávislé buněčné populace.

Čistota separované frakce, stejně tak jako výtěžek závisí na kvalitě vzorku a zvolených parametrech sortu které se odvíjí od požadavků na separované buňky. Obecně lze říci, že čím vyšší jsou požadavky na čistotu separované frakce, která se při nejpřísnějším sortovacím režimu limitně blíží 100%, tím nižší lze očekávat výtěžek.

3) Nejčastěji používané aplikace:

GFP sorty, separace vzácných lymfocytárních populací, izolace spermatogoniálních buněk.

GFP sort HeLa buněk

Výchozí vzorek	Sortované buňky	Čistota separované frakce
Porovnání GFP exprese sortovaných a nesortovaných buněk

Sort lidských NK a NK-T lymfocytů

Výchozí vzorek
Sortovaná populace CD3+CD56+	Sortovaná populace CD3-CD56+
Reanalýza sortu
Sortovaná populace CD3+CD56+	Sortovaná populace CD3-CD56+

Analýza myších spermatogoniálních buněk

Rozlišení přístroje na jednotlivých fluorescenčních detektorech.

Spherotech Rainbow Calibration Particles (8 Peaks) RCP-30-5A

Vybavení laboratoře:

Tkáňový box, termostat, centrifuga

Laboratoř je zařazena do kategorie A pro práci s GMO.

Sterilita vzorků:

Přístroj je provozován v semisterilním provozu. Pracujeme se sterilními roztoky a laboratoř je vybavena účinnou klimatizací včetně hepafiltru.

Požadavky na kvalitu vzorků:

Fyzikální vlastnosti:

Během sortu jsou buňky stresovány vysokým tlakem a průchodem úzkou kapilárou. Pro křehké a velké buňky je třeba upravit sortovací podmínky.

Kontroly:

Pro správné definování požadované buněčné populace je vhodné mít připraveny kontrolní vzorky.

 1) čisté, neznačené buňky, negativní kontrolu

 2) u vícebarevného značení „jednobarevné kontroly“ - vzorky kde bude použit jen jeden fluorochrom.

Množství buněk/ výtěžek:

Výtěžek sortu závisí na dvou faktorech. Požadované čistotě a kvalitě vzorku. Obecně lze říct, že čím vyšší čistotu požadujete, tím přísnější jsou kriteria sortu a tím menší je výtěžek. K velkým ztrátám vzorku dochází během značení buněk. S každým praním a s každou filtrací se přichází o část vzorku.

V praxi se osvědčilo počítat s 50% ztrátami během značení a sortingu.

Pořebujeme-li tedy získat 1000 buněk, které tvoří ve výchozím vzorku 10% populaci tak je vhodné počítat se 20 000 buňkami výchozího materiálu.

Příprava vzorku:

Příprava vzorků závisí velkou měrou na typu buněk se kterými klient pracuje.

Pro zdárný průběh sortu je nezbytné aby byl vzorek v suspenzi během celého procesu. U buněk, které se „lepí“ (např. makrofágy) se obvykle vzorky připravují v Ca2⁺/Mg2⁺ free mediu, v některých případech se osvědčil i obsah 0,1mM EDTA.

Před vlastním sortem se vzorek převede do bezsérového media, obvyklá je koncentrace 1x10⁷/ml.

Doba trvání sortu:

Délka soru závisí opět na kvalitě vzorku a typu buněk. Sort velkých, křehkých, adherentních buňek bude trvat delší dobu než sort buněk malých (např. thymocytů).

Orientační doba trvání sortu pro 1x10⁶ buněk výchozího materiálu za optimálních podmínek

	makrofágy	thymocyty
1x106 buněk	3 minuty	3/4 minuty